S1: qPCR için primerler tasarlarken dikkate alınması gerekenler nelerdir?

Cevap1: (1) Amplifikasyon ürünlerinin önerilen boyutu 80 – 200 bp’dir. Boyut ne kadar küçük olursa amplifikasyon verimliliği o kadar yüksek olur. Primer dimerlerden ayırt edilebilmesi için ürün boyutunun 80 bp’nin üzerinde olması gerekir, ancak boyut çok büyükse amplifikasyon verimliliği azalacaktır;

(2) 3′ ucunda GC açısından zengin veya AT açısından zengin bölgelerden kaçının;

(3) Son taban T yerine G veya C olmalıdır;

(4) İleri ve geri primerlerin Tm değerleri arasındaki fark 1°C’den fazla olmamalıdır;

(5) GC içeriği %40–%60 olmalıdır;

(6) Prob bazlı qPCR için probların Tm değeri primerlerinkinden 8°C–10°C daha yüksek olmalıdır.

 

S2: cDNA şablonunun seyreltilmesi gerekir mi? qPCR için seyreltme faktörü nedir?

Cevap2: Referans seyreltme faktörü yoktur. Genel olarak Ct değeri, cDNA’nın her 10 kat seyreltik çözeltisiyle 3,3 artar. Bu kurala göre seyreltmeleri planlayın. Şablon olarak cDNA stok çözeltisi, 10 kat seyreltilmiş çözelti ve 100 kat seyreltilmiş çözelti kullanarak qPCR gerçekleştirin ve yukarıdaki kurala göre 18–28 veya 15–33 aralığında bir Ct değeri veren bir seyreltme faktörü seçin. Alternatif olarak daha önce kullanılan kitlerin seyreltme faktörüne bakın.

Not: Test için cDNA stok çözeltisini kullanırken, cDNA, qPCR’yi inhibe eden ve büyük hacimlerde qPCR’yi engelleyebilecek birçok bileşen içerdiğinden, giriş miktarı qPCR sisteminin 1/10’unu geçmemelidir.

 

S3: Amplifikasyon eğrilerinin şekilleri anormal.

Cevap3: (1) Amplifikasyon eğrisi düzgün değil: Sinyal çok zayıf ve sistem kalibrasyonundan sonra düzgün olmayan bir eğri oluşuyor. Şablon konsantrasyonunu arttırdıktan sonra deneyi tekrarlayın.

(2) Amplifikasyon eğrisi bozulur veya azalır: Yüksek şablon konsantrasyonu nedeniyle taban çizgisi son döngüsü Ct değerinden daha yüksektir. Temel bitiş döngüsünü (Ct değeri – 4) azaltın ve verileri yeniden analiz edin.

(3) Belirli amplifikasyon eğrilerinde keskin düşüşler: Reaksiyon tüpündeki artık kabarcıklar artan sıcaklıkla patlayarak cihaz tarafından tespit edilen floresans yoğunluğunda ani bir düşüşe yol açar. Testten önce reaksiyon tüplerini kalan kabarcıklar açısından dikkatlice inceleyin.

(4) Amplifikasyon eğrisi pürüzlü ve süreksiz: ROX düzgün şekilde eklenmemiş. Referans boyayı kalibre edin.

 

S4: Standart eğri %90’ın altında veya %120’nin üzerinde bir amplifikasyon verimliliği ve zayıf bir doğrusal ilişki gösteriyor.

Cevap4: (1) Örnek yükleme hatası. Şablon seyreltme faktörünü artırın ve numune hacmini artırın. Daha doğru konsantrasyonlar elde etmek için farklı seyreltme gradyanlarını kullanın;

(2) Standart bozulmuştur. Yeni bir standart hazırlayın ve deneyi tekrarlayın;

(3) Şablon konsantrasyonu çok yüksektir ve reaksiyonu engelleyebilir. Şablon seyreltme faktörünü artırın;

(4) Primerlerin amplifikasyon spesifikliği zayıftır. Astarları yeniden tasarlayın ve deneyi tekrarlayın.

 

S5: Reaksiyonun sonunda amplifikasyon eğrisi görünmüyor.

Cevap5: (1) Yetersiz reaksiyon döngüleri: Genel olarak döngü sayısı 40’a ayarlanmıştır. Ancak çok fazla döngü arka plan sinyalini artıracak ve veri güvenilirliğini azaltacaktır.

(2) Programda sinyal edinimi adımının kurulup kurulmadığını kontrol edin: İki adımlı qPCR genellikle tavlama ve uzatma aşamalarında sinyal edinimini ayarlar; üç adımlı qPCR, 72°C uzatma aşamasında sinyal alımını ayarlar.

(3) Uygun olmayan primerler: Primerleri yeniden tasarlayın; Primerlerin bozulup bozulmadığını kontrol edin: Uzun süre saklanan primerlerin bütünlüğü, potansiyel bozulmayı dışlamak için ilk önce PAGE elektroforezi ile test edilmelidir.

(4) Çok düşük şablon konsantrasyonları: Seyreltme faktörünü azaltın ve deneyi tekrarlayın. Bilinmeyen konsantrasyonlu numuneler için önce en yüksek konsantrasyonu test edin.

(5) Şablonun bozulması: Yeni şablonlar hazırlayın ve deneyi tekrarlayın.

 

S6: Ct değerlerinin geçerliliği için kriterler

A6: (1) Erime eğrisindeki tek tepe (boya bazlı)

(2) Amplifikasyon eğrisinin üstel aşamasında, Ct değerlerinin standart sapması (STD), kopya kuyucuklar arasında < 0,2’dir.

(3) Uygun eşik

(4) Şablonsuz kontrol (NTC) ile yapılan deney, aerosol kontaminasyonunun olmadığını veya ihmal edilebilir düzeyde olduğunu göstermektedir.

(5) Ters transkriptaz kontrolü olmayan (NRT) deney, artık genomik DNA’lar tarafından kontaminasyonun olmadığını veya ihmal edilebilir düzeyde olduğunu gösterir.

(6) Amplifikasyon verimliliği (e) yaklaşık kriterleri karşılar ve %95–%105 veya %90–%120’dir; standart eğrinin korelasyon katsayısı (R2) 0,98’in üzerindedir.

 

S7: Ct değerleri çok büyük.

Cevap7: (1) Amplifikasyon verimliliği çok düşük. Üç adımlı qPCR programını kullanarak veya sentetik primerleri yeniden tasarlayarak reaksiyon koşullarını optimize edin.

(2) Şablon konsantrasyonu çok düşük. Seyreltme faktörünü azaltın ve deneyi tekrarlayın. Bilinmeyen konsantrasyonlu numuneler için önce en yüksek konsantrasyonu test edin.

(3) Şablonun bozulması. Yeni şablonlar hazırlayın ve deneyi tekrarlayın.

(4) PCR ürünü çok uzun. Önerilen PCR ürün boyutu 80 bp–150 bp’dir.

(5) Sistem PCR inhibitörleri içerir. İnhibitörler genellikle şablon tarafından tanıtılır. Şablon seyreltme faktörünü artırın veya yeni bir şablon hazırlayın ve deneyi tekrarlayın.

 

S8: NTC’nin Ct değeri varsa hedef genin Ct değeri yine de kullanılabilir mi?

Cevap8: NTC amplifikasyonu genellikle iki senaryoyu içerir:

(1) Erime eğrisinin tepe modeli, NTC ile hedef gen arasında örtüşmez. NTC genellikle hedef genden daha düşük bir Tm’ye sahiptir. Bu durumda NTC’nin Ct değeri primer dimerlerden kaynaklanır ve hedef genin Ct değerinin elde edilmesini etkilemez.

(2) Erime eğrisinin tepe modeli, NTC ile hedef gen arasında örtüşür. NTC, hedef genle aynı Tm’ye sahiptir.

Bu, sistemin aerosoller tarafından kirlendiğini göstermektedir. Bu durumda hedef genin Ct değeri yine de kullanılabilir mi?

Bunun, hedef gen ile NTC arasındaki Ct değeri (△Ct) farkı hesaplanarak belirlenmesi gerekir. △Ct ≥ 5/3, aerosol kontaminasyonunun sistem üzerinde minimum etkiye sahip olduğunu ve ihmal edilebilir olduğunu gösterir. △Ct ＜ 5/3 şiddetli kirlenmeyi belirtir; bu durumda hedef genin Ct değeri kullanılamaz.

 

S9: NRT grubunda anlamlı amplifikasyon meydana geliyor.

Cevap9: NRT’nin anlamlı amplifikasyonu genomik DNA kontaminasyonunu düşündürmektedir. Deney verilerinin kullanılabilirliği, test grubu ile NRT grubu arasındaki △Ct’den belirlenebilir. △Ct > 5, gDNA kontaminasyonunun neden olduğu sapmanın %5’ten az ve ihmal edilebilir olduğunu gösterir. △Ct < 3 veya △Ct ≈ 0, test grubundaki ürünlerin çoğunlukla gDNA’lardan amplifiye edildiğini gösterir, bu da qPCR miktarını geçersiz kılar. Bu durumda, genom çıkarma modülüne sahip bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin veya ters transkripsiyon sırasında genom çıkarma adımını ekleyin.

 

S10: Erime eğrisinin birden fazla zirvesi var.

Cevap10: (1) Kötü astar tasarımı: Primer tasarım ilkesine dayalı olarak yeni primerler tasarlayın ve sentezleyin;

(2) Primer konsantrasyonu çok yüksek: Primer konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın;

(3) cDNA şablonu genomik DNA’lar tarafından kirlenmiştir: Yeni bir cDNA şablonu hazırlayın;

(4) Spesifik olmayan amplifikasyon, Ct değerleri ≥ 30 olduğunda ortaya çıkma eğilimindedir;

(5) Tavlama sıcaklığını artırın (63°C’den yüksek değil);

(6) Şablon konsantrasyonunu artırın: Hedef gen ifadesi çok düşükse, boya bazlı qPCR, test sonuçlarını etkileyen primer dimerler üretmeye eğilimlidir. Bu durumda şablon konsantrasyonunu artırın.

 

S11: qPCR cihazı bir BadRox hatası gösteriyor.

Y11: BadRox hatasının nedeni şunlar olabilir:

(1) Cihaz sorunları: Cihazın kalibre edilmesi gerekiyor. ABI QCR cihazları yıllık olarak kalibre edilmelidir, aksi takdirde floresan sinyal alımında sorunlar ortaya çıkabilir. Eskiyen aletleri kalibre etmek veya parçaları değiştirmek için mühendislerle iletişime geçilmelidir.

(2) Müşteri, 10 ul amplifikasyon sistemi gibi küçük bir reaksiyon sistemi kullanır, bu da genel ROX konsantrasyonunun düşük olmasına ve ardından BadRox hatasına yol açar.

(3) Kitin ROX konsantrasyonu cihazın tespit eşiğinden düşüktür.

 

S12: Deneyin tekrarlanabilirliği zayıf

Cevap12: (1) Hatalı numune yükleme hacmi: Daha doğru bir pipet kullanın; Şablonu daha yüksek bir seyreltme faktörü ile seyrelterek reaksiyon sisteminin hacmini artırın.

(2) qPCR sistemindeki farklı konumlarda tutarsız sıcaklık kontrolü: Sistemi düzenli olarak kalibre edin.

(3) Şablon konsantrasyonu çok düşük. Şablon konsantrasyonu ne kadar düşük olursa tekrarlanabilirlik o kadar zayıf olur. Şablon seyreltme faktörünü azaltın veya numune hacmini artırın.

(4) 4-6 kopya kuyu tasarlayın, tekrarlanabilirliği zayıf olanları atın ve geri kalanını sonraki analiz için kullanın.

 

S13: GC açısından zengin şablonların qPCR’si için hangi ürün önerilir?

Cevap13: Q111, qPCR için önerilir.

 

S14: Referans genin Ct değeri düşük ancak hedef genin Ct değeri yüksekse numuneler nasıl seyreltilmelidir?

Y14: Referans genin qPCR’si için seyreltilmiş bir şablon ve hedef genin qPCR’si için seyreltilmemiş bir şablon kullanın. Sonuç yine de 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanabilir, çünkü iki Ct değeri çıkarma işlemi seyreltme faktörlerini iptal edecektir. Ancak aynı geni test etmek için farklı numuneler kullanıldığında seyreltme faktörünün aynı kaldığından emin olun.

 

S15: Şablon seyreltici nasıl seçilir?

Cevap15: Şablonu seyreltmek için satın alınan nükleaz içermeyen suyu, DEPC suyunu veya ev yapımı ddH2O’yu kullanın. TE, enzim aktivitesini inhibe eden EDTA içerir ve şablon seyreltici olarak kullanılmamalıdır.

 

S16: Sistemdeki aerosol kirliliği nasıl ortadan kaldırılır?

Cevap16: (1) Yeni bir Karışım, astarlar veya şablonlar kullanın.

(2) Aerosol kontaminasyonunu en aza indirmek için mümkünse reaksiyon sistemini ultra temiz bir çalışma tezgahında hazırlayın. Ultra temiz çalışma tezgahının tezgahını seyreltilmiş 84 dezenfektanla düzenli olarak silin; Pipetleri alkollü pamuk toplarıyla temizleyin ve uzun süre boyunca numune yüklemenin neden olduğu nükleik asit kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için bunları UV lambalarıyla ışınlayın.

(3) Numune yükleme odasında qPCR ürünlerinin kapağını açmayın.

(4) Vazyme #R504 RNaz, RNA ve DNA Sökücüyü kullanın.

 

S17: Gen ifadesi nasıl belirlenir?

Cevap17: Bir genin Ct değeri 30’u aşarsa, PCR ürünlerinin gradyan seyreltmesi yoluyla standart eğriyi oluşturun ve primerlerin amplifikasyon verimliliğini belirleyin. Amplifikasyon verimi %90 – %120 ise yüksek Ct değerinin düşük gen ifadesinden kaynaklandığı anlamına gelir.

 

S18: Tekrarlanan kuyucuklar arasında zayıf tekrarlanabilirlik.

Cevap18: Tekrarlanan kuyular arasındaki zayıf tekrarlanabilirlik genellikle iki senaryoyu içerir:

Senaryo 1: Ct değeri büyük olduğunda (Ct ≥ 30 gibi), zayıf tekrarlanabilirlik normaldir. Bu Poisson dağılımını karşılar. Yani, çok az sayıda etkili şablon olduğunda, şablonlar primerlere rastgele bağlanır ve bu da kopya kuyucuklar arasında Ct değerlerinde büyük farklılıklara yol açar.

Çözüm: Erime eğrisinin çeşitli tepe noktaları yoksa ve NTC ile hedef gen arasındaki △Ct 5’in üzerindeyse Ct değerleri doğru demektir. Daha fazla kopya kuyu tasarlayın ve analiz için iyi tekrarlanabilirliğe sahip kuyuların Ct değerlerini seçin.

Senaryo 2: Normal Ct değerleri (Ct < 30 gibi) ancak tekrarlanabilirlik zayıf. Bunlar genellikle sorunlu laboratuvar işlemleriyle ilgilidir.

Çözüm: Aşağıdaki yönlerden sorun giderin:

① Örnek yükleme doğruluğu; ② Pipetleme doğruluğu; ③ Düzenli qPCR sistemi kalibrasyonu.

Örnek yükleme doğruluğu

(1) Numune yükleme hatalarını azaltmak için küçük yükleme hacimlerinden kaçının. Primerleri, SYBR Green Mix ve ddH2O’yu önceden karıştırın ve daha büyük numune hacimleri yüklemek için şablon seyreltme faktörünü artırın. Örneğin, 1 µl cDNA stok solüsyonu eklemek yerine cDNA stok solüsyonunu 5 kat seyreltin, reaksiyon sistemini hazırlamak için 5 µl seyreltik solüsyonu ekleyin ve sistem hacmini ddH2O ile 20 µl’ye getirin.

(2) SYBR Yeşil Karışımı ve hazırlanan karışımı iyice karıştırın. -20°C’de buzdolabından alınan reaktifler tamamen çözülmeli ve ters çevirerek iyice karıştırılmalıdır. Reaksiyon sistemini hazırlarken, iyice karıştırmak için Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin.

Pipetleme doğruluğu

(1) Pipetleri yıllık olarak kalibre edin.

(2) Pipetler için uygun pipet uçları satın alın. Uçlar ve pipetler eşleşmezse sıvı çekerken hava sızıntısı meydana gelebilir ve bu da hatalı pipetleme hacimlerine yol açabilir. Aynı hacimdeki sıvıları çekerken uçtaki sıvı seviyelerinin aynı olup olmadığına dikkat edin.

Düzenli qPCR sistemi kalibrasyonu: Genel olarak qPCR sistemleri yıllık olarak kalibre edilir.

 

S19: Göreceli ölçüm için neden standart bir eğri oluşturulur?

Cevap19: 2-ΔΔCt formülü farklı numuneler arasındaki gen ekspresyonunu bağıl nicelik açısından karşılaştırmak için kullanıldığında, sistemin amplifikasyon verimliliği e’nin %100’e yakın olduğu varsayımı yapılır. Standart eğri, sistemin amplifikasyon verimliliği e’nin 2-ΔΔCt formülünü kullanarak doğrulamak için %100’e yeterince yakın olup olmadığını belirlemek için göreceli niceliksel olarak oluşturulur. Amplifikasyon verimliliği e büyük ölçüde %100’den farklıysa, gen ekspresyonunu karşılaştırmak için gerçek amplifikasyon verimliliği kullanılmalıdır.

 

S20: Mutlak ölçüm nasıl yapılır?

Cevap20: Standart olarak kopya numarası/konsantrasyonu bilinen bir numune kullanın. Standardı en az 5 gradyan konsantrasyonuna kadar seyreltin ve seyreltilmiş standardı ve qPCR için test örneğini aynı anda yükleyin. Standartların kopya numaralarının Günlüğünü x ekseni ve standartların Ct değerlerini y ekseni olarak kullanarak standart bir eğri oluşturun. Kopya sayısını/konsantrasyonunu elde etmek için test numunesinin Ct değerini standart eğri denkleminde değiştirin.