Açıklama
Ürün Özellikleri
Ultra yüksek doğruluk: Doğruluk, Taq DNA Polimerazınkinin 128 katıdır;
Daha hızlı amplifikasyon: Sınır hızı 0,5 saniye/kb’ye ulaşabilir, 30 saniye/kb çoğu parçayı verimli bir şekilde yükseltebilir;
Daha uzun amplifikasyon: Plazmid ve λ DNA gibi basit şablonların etkili amplifikasyon uzunluğu 40 kb’ye, genomun etkili amplifikasyon uzunluğu 20 kb’ye ve cDNA’nın etkili amplifikasyon uzunluğu 10 kb’ye ulaşabilir;
Geniş uyarlanabilirlik: Çeşitli GC içerik parçalarının amplifikasyonu için uygundur, PCR inhibitörlerine karşı süper toleransa sahiptir ve çeşitli numunelerin doğrudan PCR’si için kullanılabilir;
Basit işlem: Boya ön karışımı, deneysel adımları en aza indirin.
Anahtar veri
1. Mükemmel yüksek GC amplifikasyon kapasitesi
654 bp, 900 bp, 800 bp, 1.200 bp, 1.400 bp ve 426 bp hedef fragmanları, şablon olarak insan genomu kullanılarak amplifiye edildi ve her amplikonun GC içeriği %68’den yüksekti.
2. Güvenilir amplifikasyon doğruluğu
3. Kararlı ham amplifikasyon yeteneği
Bileşenler
| Components | P515-01 | P515-02 | P515-03 |
| 2 × Phanta Max Master Mix | 1 ml | 5 × 1 ml | 15 × 1 ml |
Depolama
18 aya kadar -30 ~ -15°C’de saklayın ve ≤0°C’de taşıyın.
▲ Tekrar tekrar dondurup çözdürmekten kaçının.
SSS
S1: Amplifikasyon verimliliği düşük ve test grubunda güçlendirilmiş bant yok.
A1: (1) Astarlar
Sentetik astarların uygunsuz saklama nedeniyle bozulup bozulmadığını kontrol edin; Primer tasarımını gözden geçirin ve primer spesifikliğini incelemek veya primerleri yeniden tasarlamak için BLAST’ı kullanın.
(2) Şablon
Uzun süreli depolama veya tekrarlanan donma-çözülme döngüleri DNA’nın kırılmasına, çentiklenmesine veya bozulmasına yol açacağından şablon, taze hazırlanmış çift sarmallı DNA olmalıdır. Şablondaki aşırı yüksek GC içeriği, DNA çift sarmallarının ayrılmasını zorlaştıracaktır; bu durumda erime sıcaklığını etkili bir şekilde düşürmek için PCR Güçlendirici (Kat. No. P021) ekleyin. Ham numune şablonları inhibitörler içerebilir, bu nedenle şablon konsantrasyonunun düşürülmesi önerilir (seyreltmeden sonra kullanın; bir bitki yaprağı kullanılıyorsa bitkinin polisakkaritler veya polifenoller açısından zengin olmadığından emin olun, taze, genç bir yaprak alın ve budayın) sarı pipet ucunun boyutuna kadar). cDNA kullanılıyorsa ters transkripsiyon için kullanılan RNA’nın saflığını ve bütünlüğünü kontrol edin.
(3) Enzim
Reaksiyonda kullanılan enzim inaktive edilmiştir. Deneyi taze bir enzimle veya başka bir kaynaktan gelen bir enzimle tekrarlayın.
(4) Amplifikasyon sistemi
Reaksiyon sistemi yanlış hazırlanmıştır. Deneyi doğru sistemle tekrarlayın.
(5) Reaksiyon programı
Denatürasyon sıcaklığının doğru olup olmadığını ve PCR sisteminde görüntülenen sıcaklığın gerçek sıcaklıkla aynı olup olmadığını kontrol edin. Sıcaklık çok yüksekse, enzim ilk birkaç döngüde hızla etkisiz hale gelecektir. Sıcaklık çok düşükse şablon tamamen denatüre olmayacaktır. Şablon olarak maya kullanılırsa ön denatürasyon süresi 10 dakikaya kadar uzatılabilir. Tavlama sıcaklığı uygun değilse, tavlama sıcaklıklarının eğimini test ederek uygun tavlama sıcaklığını belirleyin. Hedef fragman uzunsa touchdown PCR programını deneyin. Uzatma süresinin yeterli olup olmadığını kontrol edin.
S2: Güçlendirilmiş bantlar soluk.
A2: (1) Astarlar
Sentetik astarların bozulup bozulmadığını kontrol edin.
(2) Şablon
Şablonun kalitesini kontrol edin. Uzun süreli depolama veya tekrarlanan donma-çözülme döngüleri DNA’nın kırılmasına, çentiklenmesine veya bozulmasına yol açacağından şablon olarak taze hazırlanmış çift sarmallı DNA kullanılmalıdır. Şablon tükenmişse, sonraki amplifikasyon için şablon olarak ilk amplifikasyon ürününün seri dilüsyonlarını kullanın.
(3) Reaksiyon programı
Touchdown PCR programını deneyin; Uzatma süresini ve döngü sayısını artırın.
S3: Amplifikasyonun özgüllüğü zayıf veya spesifik olmayan ürünler var.
A3: (1) Astarlar
Astar tasarımı optimal değildir. Primerler, hedef sekanstaki spesifik olmayan bölgelere veya dimerler oluşturmak üzere birbirlerine bağlanmışsa, primer konsantrasyonunu azaltarak veya gerekirse primerleri yeniden tasarlayarak optimize edin.
(2) Şablon
Şablon saf değilse veya kirlenmişse yeni bir şablon hazırlayın.
Şablon bozulmuşsa veya çok fazla şablon kullanılmışsa, şablonun bütünlüğünü ve konsantrasyonunu elektroforezle inceleyin ve gerekirse şablonu tekrar saflaştırın. Şablon giriş miktarı için Kullanım Talimatlarına bakın.
(3) Reaksiyon programı
Reaksiyon programı optimal değil. Hedef banttan daha küçük spesifik olmayan çeşitli bantlar varsa tavlama sıcaklığını artırın ve döngü sayısını azaltın. Hedef banttan daha büyük spesifik olmayan çeşitli bantlar varsa, uzatma süresini ve döngü sayısını azaltın.
S4: Amplifikasyon ürünleri bir jel üzerinde çalıştırıldığında bantlar dağılıyor veya bulaşıyor.
A4: (1) Jel
Hazırlama sırasında jeli tamamen eritin.
(2) Astarlar
Primerlerin bozulup bozulmadığını kontrol edin.
(3) Şablon
Şablonun kalitesi düşük veya aşırı. Elektroforez yoluyla şablonun bütünlüğünü ve konsantrasyonunu inceleyin ve gerekirse yeni bir şablon hazırlayın. Şablon giriş miktarı için Kullanım Talimatlarına bakın. Hedef bant uzunsa ve şablon olarak cDNA kullanılıyorsa, ters transkripsiyon için kullanılan RNA’nın saflığını ve bütünlüğünü kontrol edin ve rastgele primerler olmadan ters transkripsiyon işlemini yeniden gerçekleştirin.
(4) Reaksiyon programı
Reaksiyon programı optimal değil. Tavlama sıcaklığı uygun değilse, tavlama sıcaklıklarının eğimini test ederek uygun tavlama sıcaklığını belirleyin. Touchdown PCR programını deneyin.
S5: Boş kontrol (NTC) grubunda amplifikasyon ürünleri var.
A5: (1) Sorunlu astar tasarımı
Amplifiye edilmiş sekans, hedef olmayan sekansa homologdur. Böylece hedef olmayan diziler de PCR’de çoğaltılır.
(2) Amplifikasyon ürününe karşılık gelen bant hedef bantlarla aynı boyuta sahipse bu kontaminasyonu gösterir.
Deneyi taze bir Karışım, su veya astarlarla tekrarlayın. Aerosol kontaminasyonunu en aza indirmek için reaksiyon sistemini ultra temiz bir çalışma tezgahında hazırlayın.
(3) Hedef sekansın genom veya büyük parçalar tarafından çapraz kontaminasyonunu önlemek amacıyla, hedef sekansın yükleme pipetine pipetlenmesini veya santrifüj tüplerinden dökülmesini önlemek amacıyla adımları dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.
(4) Hedef genin havadaki küçük nükleik asit fragmanları tarafından kontaminasyonunu önlemek amacıyla kontaminasyonu azaltmak veya ortadan kaldırmak için iç içe PCR yöntemini kullanın.
S6: Yüksek kaliteli polimerazın kalitesi zayıf ve mutasyonlara neden oluyor.
A6: Yüksek kaliteli PCR’deki mutasyonlar aşağıdaki yönlerden analiz edilebilir:
(1) Şablonda mutasyonlar var.
Şablonun mutasyona uğrayıp uğramadığını kontrol edin. Plazmit ise sıralama için gönderin. Eğer cDNA ise testi tekrarlayın; Mutasyon hala mevcutsa cDNA’da sorunlar olabilir. Bu durumda RNA’nın bütünlüğü ve saflığı kontrol edildikten sonra yeni cDNA’ların hazırlanması önerilir.
(2) Mutasyon, şablonun uzun süre UV ışığına maruz kalmasından kaynaklanabilir.
Jel ekstraksiyonu sırasında uzun süre UV’ye maruz kalmaktan kaçının.
(3) Gen dizisi NCBI dizisi ile tutarsızdır.
Dizileme için DNA’yı yeniden gönderin. Sonuç aynı kalırsa bu, sıralamanın NCBI’da listelenenlerle tutarsız olabileceği anlamına gelir.
(4) Benzer rekombinant diziler yanlış rekombinasyona yol açar.
S7: Yüksek kaliteli PCR için şablon olarak ters transkripsiyon ürünü cDNA kullanılırsa kaç şablon girilmelidir?
Cevap7: Kullanım Talimatlarında önerilen cDNA şablonu giriş miktarı 1–5 μl’dir (PCR sisteminin toplam hacminin 1/10’undan fazla olmamalıdır). Bu aralıktaki farklı şablon miktarlarını test ederek uygun giriş miktarını belirleyin.
S8: Yüksek kaliteli polimerazlarla elde edilen amplifikasyon ürünlerinin poli(A) kuyrukları var mı? Poli(A) kuyrukları nasıl eklenir?
Cevap8: (1) Yüksek kaliteli polimerazlarla elde edilen amplifikasyon ürünlerinin poli(A) kuyrukları yoktur. Sonraki klonlama için Vazyme’in kesintisiz klonlama ürünü C601’i deneyin; TA klonlama için evrensel bir Taq polimeraz kullanarak bir poli(A) kuyruğu ekleyin:
Poli(A) kuyruklama yöntemi: Yalnızca Taq polimeraz içeren 10 ul sistem:
| 1 ul 10 × Taq Tamponu (MgCl2 içeren)
0,5 ul 10 mM dNTP 0,2 ul Taq DNA polimeraz (primer içermeyen) 1 – 7 µl saflaştırılmış PCR fragmanları 10 ul’ye ddH2O ekleyin |
|
Taq karışım sistemi: |
|
2× Taq Master Karışımı 5 μl Saflaştırılmış PCR parçaları ddH2O ] |
|
Reaksiyon koşulları: 72°C 10 dk. |
Değerlendirmeler
Henüz değerlendirme yapılmadı.